空间转录组: DLPFC数据集分析 (2)

引言

本系列讲解 空间转录组学 (Spatial Transcriptomics) 相关基础知识与数据分析教程，持续更新，欢迎关注，转发，文末有交流群！

归一化

使用 library size normalization 计算经过对数变换的归一化计数（logcounts）。我们使用来自 scater 和 scran 包的方法，做出简化假设，即 spots 可以被视作等同于 single cells。

# calculate library size factors
spe <- computeLibraryFactors(spe)

summary(sizeFactors(spe))

##     Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max. 
##   0.1330  0.6329  0.8978  1.0000  1.2872  3.7820

hist(sizeFactors(spe), breaks = 20, main = "Histogram of size factors")

# calculate logcounts
spe <- logNormCounts(spe)

assayNames(spe)

##  [1] "counts"    "logcounts"

特征选择（HVGs）

应用特征选择方法以识别一组顶级高变异基因（HVGs）。我们使用 scran包的方法，再次做出简化假设，即 spots 可以被视作等同于 single cells。

我们还首先移除线粒体基因，因为这些基因通常表达非常高，且不是主要生物学关注点。

# remove mitochondrial genes
spe <- spe[!is_mito, ]
dim(spe)

##  [1] 33525  3614

# fit mean-variance relationship, decomposing variance into 
# technical and biological components
dec <- modelGeneVar(spe)

# select top HVGs
top_hvgs <- getTopHVGs(dec, prop = 0.1)

# number of HVGs selected
length(top_hvgs)

##  [1] 1424

降维

接下来，我们使用主成分分析（PCA）对顶级高变异基因（HVGs）进行降维。我们保留前 50 个主成分（PCs）以供后续下游分析。这样做既能减少噪声，也能提高计算效率。我们还在前 50 个 PCs 上运行 UMAP，并保留前 2 个 UMAP 成分用于可视化。

我们使用 scater 包中计算高效的 PCA 实现，该实现使用随机化，因此需要设置随机种子以保证可重复性。

# using scater package
set.seed(123)
spe <- runPCA(spe, subset_row = top_hvgs)
spe <- runUMAP(spe, dimred = "PCA")

reducedDimNames(spe)
##  [1] "PCA"  "UMAP"

dim(reducedDim(spe, "PCA"))
##  [1] 3614   50

dim(reducedDim(spe, "UMAP"))
##  [1] 3614    2

# update column names for plotting
colnames(reducedDim(spe, "UMAP")) <- paste0("UMAP", 1:2)

聚类

接下来，我们应用聚类算法以识别细胞类型或空间域。请注意，在此示例中，我们仅使用分子特征（基因表达）作为聚类的输入。

在此，我们使用基于图的聚类，采用 scran 中实现的 Walktrap 方法，应用于上述基于顶级高变异基因（HVGs）计算出的前 50 个主成分（PCs）。

# graph-based clustering
set.seed(123)
k <- 10
g <- buildSNNGraph(spe, k = k, use.dimred = "PCA")
g_walk <- igraph::cluster_walktrap(g)
clus <- g_walk$membership
table(clus)
##  clus
##    1   2   3   4   5   6   7 
##  365 765 875 803 198 370 238

# store cluster labels in column 'label' in colData
colLabels(spe) <- factor(clus)

通过在X-Y空间中绘制群集标签，并与该数据集可用的手动注释参考标签（ground_truth）一起绘制。

# plot cluster labels in x-y space
plotCoords(spe, annotate = "label", pal = "libd_layer_colors")

# plot manually annotated reference labels
plotCoords(spe, annotate = "ground_truth", pal = "libd_layer_colors")

# plot clusters labels in UMAP dimensions
plotDimRed(spe, plot_type = "UMAP", annotate = "label", 
           pal = "libd_layer_colors")